Биоразложение ЦСС микромицетами

Получение биогаза в процессе микробной биотрансформации различных органических субстратов является одним из наиболее эффективных альтернативных процессов получения энергии. Целлюлозосодержащие субстраты (ЦСС) рассматриваются как перспективные источники углерода, поскольку преобладают в составе твердых органических бытовых отходов.

Целлюлоза встречается в природе почти исключительно как компонент растительных клеточных стенок, ее содержание, как правило, составляет 35–50% от сухой массы. Более сложный биополимер – гемицеллюлоза составляет 5–35% лигноцеллюлозной биомассы растений. Присутствие лигнина, его сложная структура, высокий молекулярный вес и низкая растворимость замедляют скорость и полноту биоразложения ЦСС. В различных видах растительных материалов содержание лигнина может составлять (%): 18–35 – древесина, 30–40 – скорлупа орехов, 10?30 – трава, 0–15 – смесь различного типа бумаги, 15 – пшеничная солома, 0 – листья, 18–30 – газета.

Одним из способов повышения утилизации ЦСС, в том числе за счет удаления лигнина, является предобработка. Применяют различные и не всегда дешевые способы, которые включают механическое измельчение, перемалывание, гидротермолиз, автогидролиз и пиролиз при температурах выше 300°C, использование гамма- и сверхвысокочастотных (микроволновых) излучений. Химическая предобработка ЦСС включает озонолиз, щелочной гидролиз и гидролиз с помощью концентрированных и разбавленных кислот, а также оксидирование пероксидом водорода во влажной атмосфере, так называемый “органосолв”.

Среди микромицетов наиболее активными видами, разрушающими лигнин, являются Trametes versicolor, Ceriporia lacerata, Stereum hirsutum, Polyporus brumalis, Phanerochaete chrysosporium и Cyathus stercoreus. Ферментные препараты получают также из Trichoderma reesei, Humicola insolens и Thermofida fusca. Преимуществами предобработки с помощью микромицетов является отсутствие каких-либо вредных и агрессивных химических реагентов, низкая себестоимость процесса и невысокие энергетические затраты на его осуществление, и кроме того, экологическая безопасность. Однако это длительный процесс, требующий контроля за динамикой роста и условиями культивирования микроорганизмов. Кроме того, разложение микромицетами лигнина происходит при одновременном использовании целлюлозы и/или гемицеллюлозы, что делает этот процесс менее привлекательным.

В структуре фибриллярной целлюлозы чередуются области с высокой степенью упорядоченности кристаллической структурой и неоднородные, аморфные зоны, отличающиеся рыхлой структурой, что позволяет фибриллам изгибаться и скручиваться. Эти неоднородные участки в первую очередь и подвергаются воздействию гидролитических ферментов микроорганизмов. Несмотря на наличие целлюлазной активности у ряда аэробных бактерий – представителей родов Acidothermus, Bacillus, Caldibacillus, Cellulomonas, Cellvibrio, Cytophaga, Dyella, Erwinia, Micromonospora, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Sporocytophaga, Thermomonospora, Rhodothermus, Thermobifida, наибольшую активность в разложении целлюлозы проявляют анаэробные бактерии, обладающие такой мультиферментной системой как целлюлосома, способной осуществлять взаимодействие целого ряда гидролитических ферментов. Анаэробные бактерии входят в состав микробных сообществ наряду с другими гидролитиками и диссипотрофами, синтрофами, ацетогенами и метаногенами. Благодаря активности метаногенов возможно получение биогаза, который состоит, в основном, из метана (55–75%) и двуокиси углерода (25–45%) со следовыми количествами азота, сероводорода, кислорода. Для получения биогаза могут быть использованы различные виды органических субстратов, но основным сырьем на промышленных и коммерческих предприятиях остаются навоз сельскохозяйственных животных и помет птиц, а также органическая часть бытовых и муниципальных отходов. Для повышения выхода биогаза используют дополнительные косубстраты – “энергетические растения”, например, кукурузу, сахарный тростник, просо, сорго, мискантус и др.

Цель работы – изучение разложения бумажных отходов в анаэробных условиях, влияния предобработки целюлозосодержащих материалов с использованием микромицетов на последующую их конверсию в биогаз, а также использование в качестве косубстрата фитомассы топинамбура для увеличения эффективности биоконверсии в метан.

Культуры микроорганизмов и условия их культивирования. В работе использовали культуры микромицетов Aspergillus terreus штамм № 2 из коллекции кафедры микробиологии МГУ и Trichoderma viride, ранее выделенный из ризопланы Dendrobium moschatum (Buch. – Ham.) Swartz. Грибы культивировали на минеральной среде Чапека–Докса. В качестве источника углерода вносили сахарозу в количестве 30.0 г/л или целлюлозосодержащие материалы такие, как обеззоленные фильтры (МРТУ 6-06-2411-65), журнальную, газетную и офисную бумагу с черно-белой печатью и гофрированный картон, которые предварительно разрезали на кусочки 0.5 см². Для получения инокулята грибы предварительно выращивали на агаризованной (1.5% агар-агара) среде Чапека–Докса в течение 7 сут. Посевной материал вносили либо в виде фрагментов (0.2–0.5 см) поверхностной культуры из расчета 2 см²/100 мл среды, либо в виде суспензии спор, для чего с поверхностной культуры гриба делали смыв стерильной водопроводной водой (3 мл на 100 мл среды). Культивирование проводили в качалочных колбах со 100 мл среды на качалке при 150 об./мин температуре 28–30°C в темноте в течение 10 сут.

Анаэробное сообщество. В качестве анаэробного сообщества использовали суммарное микробное сообщество (?4), селектированное ранее из навоза крупного рогатого скота (КРС), донных осадков пруда, навоза зебры и антилопы (зоопарк, Москва). В качестве субстрата использовали целлюлозосодержащие материалы или смесь бумаг, состоящую из картона, фильтровальной, журнальной, газетной и офисной бумаг. Кроме того, использовали высушенные и измельченные листья и стебли топинамбура, которые вносили в количестве 15 г/л. Посевной материал (в том числе навоз КРС) в количестве 10% вносили в 30 мл питательной среды в анаэробные флаконы на 100 мл. Термофильное сообщество ?4 инкубировали в темноте при температуре 55°C в термостате BD 115 (“Binder”, Германия). Активность сообществ микроорганизмов определяли по увеличению содержания метана в составе биогаза.

Предобработка целлолозосодержащих материалов. Для изучения влияния предобработки целлюлозосодержащих материалов грибами твердый остаток, полученный после культивирования микромицетов, использовали для сбраживания микробными анаэробными сообществами. Было поставлено несколько вариантов эксперимента.

Инокулят A. terreus вносили в жидкую среду Чапека в виде фрагментов поверхностной культуры или в виде суспензии спор. Для определения влияния состава питательной среды на активность микромицетов помимо офисной бумаги (15 г/л) в среду вносили косубстрат – сахарозу (30 г/л). После 10 сут культивирования A. terreus биомассу гриба, образовавшийся твердый осадок и культуральную жидкость (КЖ) использовали как субстрат для последующего получения биогаза с помощью анаэробных метаногенных сообществ. В другом варианте эксперимента твердый осадок и КЖ предварительно подвергали термической обработке (автоклавирование при 121°C, 30 мин).

Биомассу и КЖ, используемые для дальнейшего дображивания анаэробными сообществами, вносили во флаконы или разбавляли в 2 раза питательной средой для метаногенов (конечный объем в обоих случаях 30 мл). Флаконы для культивирования анаэробных микробных сообществ герметично закрывали и проводили замену газовой фазы на аргон, инокуляцию анаэробными микробными сообществами в количестве 3 мл и культивировали при температуре 55°C.

Для изучения влияния предобработки субстрата и динамики культивирования T. viride на эффективность последующего биоразложения целлюлозосодержащих субстратов (офисная бумага, смесь бумаг и фитомасса топинамбура) использовали следующую схему эксперимента. Микромицеты культивировали на среде Чапека–Докса без сахарозы в течение 9 сут, отбор проб проводили в начальной точке, а также на 3, 5 и 9 сут. Затем по 15 мл культуры гриба центрифугировали при 7000 g 20 мин, осадок переносили во флаконы, добавляли 30 мл среды для метаногенных сообществ, проводили замену газовой фазы, как описано выше, засевали метаногенным сообществом (10% по объему) и культивировали при 55°C.

Газовая хроматография. Определение концентрации метана (СН4), углекислого газа (СО2) и водорода (Н2) осуществляли методом газовой хроматографии на хроматографе Кристалл 2000 М (“Хроматэк”, Россия) по ранее описанной методике.

Оценка роста и развития микроорганизмов. Рост анаэробных микробных сообществ оценивали по изменению цвета и мутности, изменению рН, образованию биогаза и разложению целлюлозосодержащих субстратов. При культивировании микромицетов в КЖ определяли содержание белка по Бредфорд (у A. terreus) и Лоури (у T. viride), оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Hitachi 200-20 (“Hitachi”, Япония) при 595 нм и 650 нм соответственно. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Содержание в КЖ растворимых сахаров определяли по Миллеру. Для построения калибровочной кривой использовали глюкозу. Аликвоту КЖ смешивали с динитросалициловой кислотой (ДНСК) в соотношении 1: 3, кипятили на водяной бане 5 мин. Оптическую плотность растворов после охлаждения измеряли на спектрофотометре при 540 нм.

Определение целлюлозолитической активности. Для определения активности 5 мл КЖ фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм (“Millipore”, США). Для определения активности ?-1,4-эндоглюканазы использовали карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, “Sigma”, США). К 0.5 мл КЖ добавляли 0.5 мл 1%-ного раствора КМЦ, приготовленного на 0.1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5.3, и инкубировали 60 мин при 50°C. В качестве контроля использовали КЖ, предварительно прогретую 30 с при 100°C для инактивации фермента. Затем пробы охлаждали на льду, центрифугировали 2 мин при 4000 g, отбирали 1.0 мл надосадочной жидкости и смешивали с 3 мл ДНСК для определения восстанавливающих сахаров. Оптическую плотность определяли при 540 нм на спектрофотометре Hitachi 200-20. За единицу активности (ед.) ?-1,4-эндоглюканазы принимали количество мкМ глюкозы, образовавшейся после гидролиза субстрата (КМЦ) в 1 мл за 1 мин в условиях реакции. Концентрацию глюкозы рассчитывали по калибровочной кривой в интервале 0.1–1.0 мг/мл. Активность рассчитывали на мг белка в КЖ.

Для определения общей целлюлозолитической активности в качестве субстрата использовали фильтровальную бумагу Whatman № 1, (“Whatman”, США). Для определения в пробирку Эппендорфа вносили 1 мл 0.1 М натрий-ацетатного буфера и сложенную “гармошкой” фильтровальную бумагу (0.5 г, 1 ? 6 см), добавляли 0.5 мл фильтрата КЖ и инкубировали 60 мин при 50°C. По окончании реакции отбирали 1 мл раствора, в котором определяли образовавшиеся восстанавливающие сахара с ДНСК, как описано выше. За единицу активности (ед.) принимали количество мкМ глюкозы, образовавшейся в результате гидролиза субстрата за 1 мин в мл в условиях реакции.

Разложение бумаги грибами Trichoderma viride и Aspergillus terreus. На первом этапе было изучено образование целлюлаз при выращивании двух отобранных видов микромицетов на нескольких типах бумажных отходов: фильтровальная, газетная, журнальная бумага, офисная бумага с черно-белой печатью, гофрированный картон и смесь всех вышеперечисленных видов субстратов. Для культивирования использовали минеральную среду Чапека–Докса, поскольку известно, что именно на небогатых по составу питательных средах образуются большие количества целлюлозолитических ферментов. В ряде случаев, добавление сахарозы в качестве косубстрата позволяет увеличить продукцию целлюлаз, поэтому было проведено сравнение образования целлюлаз микромицетами на минеральной среде с бумагой и на той же среде с добавлением сахарозы.

Максимальные значения целлюлозолитической активности в КЖ T. viride были получены на 3–7 сут культивирования (рис. 1): на офисной бумаге – 0.8 ед./мл (10.2 ед./мг белка) и смеси бумаг – 0.73 ед./мл (2.9 ед./мг белка).

Рис. 1. Общая целлюлозолитическая активность (а, б), активность ?-1,4-эндоглюконазы (в, г) T. viride при культивировании на целлюлозосодержащих субстратах.
а, в: 1 – фильтровальная бумага; 2 – фильтровальная бумага + сахароза; 3 – офисная бумага; 4 – офисная бумага + сахароза; 5 – смесь бумаг; 6 – смесь бумаг + сахароза.
б, г: 1 – журнальная бумага; 2 – журнальная бумага + сахароза; 3 – газетная бумага; 4 – газетная бумага + сахароза; 5 – картон; 6 – картон + сахароза.

На офисной бумаге наибольшая активность достигалась уже на 3 сут культивирования, в то время как на смеси бумаг – на 7 сут (рис. 1а), поскольку она труднее подвергалась разложению из-за присутствия лигнина. Наиболее высокие значения активности эндоглюканазы в КЖ были получены также при культивировании на офисной бумаге – 0.3 ед./мл (3.7 ед./мг белка), смеси бумаг – 0.25 ед./мл (0.9 ед./мг белка) и картоне – 0.28 ед./мл (0.86 ед./мг белка). Из данных литературы известно, что целлюлозолитическая активность T. viride QM 9123 составляла 0.8 ед./мл при культивировании на среде с ячменной соломой, а активность эндоглюканазы T. reesei QM 9414 в КЖ при выращивании на среде с микрокристаллической целлюлозой – 0.4–0.5 ед./мл.

Известно, что ферменты целлюлозолитического комплекса являются индуцируемыми. Было показано, что добавление в среду для T. viride сахарозы в качестве дополнительного источника углерода не приводило к увеличению синтеза целлюлаз в то время, как наличие в среде глюкозы увеличивало активность ферментов в КЖ. В то же время в работе показано, что сахароза, смешанная с субстратом в соотношении 1 : 1, стимулировала образование целлюлаз у Aspergillus sydowii. Внесение в среду для выращивания T. viride сахарозы стимулировало образование ?-1,4-эндоглюканазы (рис. 1в, г), но при этом активность по фильтровальной бумаге не изменялась (рис. 1а, б). Добавление сахарозы повышало максимальное образование ?-1,4-эндоглюканазы T. viride при выращивании на офисной бумаге в 1.3 раза, на журнальной – в 1.4, на газетной в 5 и на смеси бумаг – в 2 раза. Наибольший эффект наблюдался при использовании трудноразлагаемых субстратов (газетная, журнальная и смесь бумаг), при этом максимум активности фермента достигался в более ранние сроки. Активность целлюлозолитических ферментов на среде без сахарозы в 2–3.2 раза превышала таковую на среде с сахарозой (рис. 2а).

Рис. 2. Максимальные значения активностей эндоглюканазы (I) и общей целлюлазной (II) T. viride (а) и A. terreus (б) при культивировании на различных типах бумажных субстратов с добавлением сахарозы и без нее.
а: 1 – фильтровальная бумага; 2 – фильтровальная бумага + сахароза; 3 – смесь из картона, фильтровальной, журнальной, газетной и офисной бумаг; 4 – смесь бумаг + сахароза; 5 – журнальная бумага; 6 – журнальная бумага + сахароза; 7 – газетная бумага; 8 – газетная бумага + сахароза; 9 – картон; 10 – картон + сахароза; 11 – офисная бумага; 12 – офисная бумага + сахароза.
б: 1 – офисная бумага; 2 – офисная бумага + сахароза; 3 – фильтровальная бумага; 4 – фильтровальная бумага + сахароза; 5 – картон; 6 – картон + сахароза; 7 – газетная бумага; 8 – газетная бумага + сахароза; 9 – журнальная бумага; 10 – журнальная бумага + сахароза; 11 – смесь бумаг; 12 – смесь бумаг + сахароза.

Более высокие значения активности при использовании в качестве субстрата газетной бумаги с косубстратом могут быть связаны с более высокой активностью ?-1,4-эндоглюканазы или, возможно, с повышенным содержанием редуцирующих сахаров в среде. Известно, что при выращивании видов Trichoderma spp. на рисовой соломе восстанавливающие сахара, не связанные с гидролизом гликозидных связей субстрата, также могут обнаруживаться при анализе с использованием реактива ДНСК. Результаты экспериментов по разложению бумажных отходов другим микромицетом, Aspergillus terreus шт. № 2, представлены на рис. 2 и 3.

Рис. 3. Общая целлюлозолитическая активность (а, б), активность ?-1,4-эндоглюконазы (в, г) A. terreus при культивировании на целлюлозосодержащих субстратах.
а, в: 1 – офисная бумага; 2 – офисная бумага (+ сахароза); 3 – фильтровальная бумага ; 4 – фильтровальная бумага (+ сахароза); 5 – смесь бумаг; 6 – смесь бумаг (+ сахароза);
б, г: 1 – журнальная бумага; 2 – журнальная бумага (+ сахароза); 3 – газетная бумага; 4 – газетная бумага (+ сахароза); 5 – картон; 6 – картон (+ сахароза).

Наибольшую общую целлюлозолитическую активность у A. terreus наблюдали на 7 сут при выращивании на картоне (0.63 ед./мл или 1.6 ед./мг белка), в 2 раза меньше на смеси бумаг – 0.32 ед./мл (0.7 ед./мг белка) и на офисной бумаге (0.3 ед./мл или 0.6 ед./мг белка) (рис. 3а, б), как и при выращивании T. viride, более высокую активность наблюдали на среде без сахарозы. Однако штамм T. viride оказался более эффективным при культивировании практически на всех типах использованных субстратов, исключение составляют показатели, полученные на картоне, 0.63 ед./мл у аспергилла и 0.49 ед./мл у триходермы. На остальных субстратах общая целлюлозолитическая активность триходермы превышала активность аспергилла в 2.6 раз на офисной бумаге, в 3.1 раза на журнальной, в 2.7 раз на фильтровальной, в 1.7 раз на газетной и в 2.3 раза на смеси бумаг.

При сходных показателях активности эндоглюканазы в КЖ A. terreus, выращенного на офисной бумаге, максимум (0.18 ед./мл, 1.5 ед./мг белка) наблюдали без сахарозы на 7 сут, а при ее добавлении – 0.19 ед./мл, (0.3 ед./мг белка) на 5 сут. На таких субстратах, как фильтровальная бумага и смесь бумаг, в целом, динамика активности эндоглюканазы была сходной на среде с сахарозой и без нее (рис. 3в). Увеличение активности эндоглюканазы было отмечено при культивировании гриба на журнальной бумаге и картоне, в других случаях, в отличие от T. viride, добавление сахарозы не приводило к увеличению биосинтеза фермента. Наибольшая активность эндоглюканазы в КЖ A. terreus составила 0.27 ед./мл (0.30 ед./мг белка) при использовании газетной бумаги в качестве субстрата (рис. 3г). По имеющимся данным литературы, общая целлюлозолитическая активность A. terreus при его культивировании на КМЦ, отрубях и фильтровальной бумаге – 0.3, 1.3 и 0.3 IU/мл соответственно. В другой работе активность эндоглюканазы A. sydowii была 0.3 IU/мл на среде с 1%-ной КМЦ.

Сравнение общей целлюлозолитической и эндоглюканазной активностей двух изученных микромицетов показало что более эффективным штаммом является T. viride (рис. 2а, б). Кроме того, штамм T. viride имел более высокую активность ферментов в КЖ, которая достигалась при выращивании этого микромицета за более короткие сроки.

Наиболее эффективно гидролизуемыми субстратами для изученных грибов являются офисная бумага, картон и смесь бумаг. Известно, что в картоне и офисной бумаге содержание лигнина минимально и колеблется от 2% в офисной бумаге до 24% в газетной бумаге. В то же время, именно смесь бумажных отходов, включая и легко- и трудноразлагаемые субстраты, позволяет повысить эффективность их биоразложения. У обоих микромицетов при культивировании на смеси бумаг обнаружены высокие показатели целлюлазной активности. Это может быть связано с тем, что на смешанных лигнинсодержащих субстратах микроорганизмы вырабатывают целый комплекс целлюлозолитических ферментов, благодаря чему синергетическое действие ферментов и эффективность гидролиза возрастают. Известен синергизм между целлобиогидролазой I Trichoderma reesei, эндоксиланазой и ацетилксиланэстеразой. Так, на примере биомассы кукурузы, количество образовавшейся при гидролизе этого субстрата целлобиозы, увеличивалось на 13–84%, по сравнению с действием только целлобиогидролазы.

На основании полученных данных для дальнейших исследований был отобран штамм T. viride, а в качестве оптимальных условий для проявления общей целлюлозолитической активности и разложения бумажных отходов – минеральная среда Чапека–Докса без сахарозы.

Предобработка целлюлозосодержащих субстратов микромицетами с последующим сбраживанием образующейся биомассы анаэробными сообществами. Грибы имеют явное преимущество при переработке лигноцеллюлозных материалов, при этом наиболее активными являются грибы белой гнили. Лигнин препятствует доступу ферментов целлюлолитического комплекса к целлюлозе в растительной биомассе. Предварительная обработка таких субстратов при их сбраживании микробными анаэробными сообществами позволяет получить прирост выхода метана на 24–30% по сравнению с необработанным субстратом. Условия предобработки целлюлозосодержащих субстратов и результаты последующего сбраживания в биогаз представленные в табл. 1.

Для определения оптимальных условий: состав среды, характер инокулята, а также необходимости дополнительной термической обработки (автоклавирование) биомассы, используемой в качестве питательного субстрата для микробных сообществ, культивирование сначала проводили только на одном типе субстрата – офисной бумаге в течение 10 сут. При анаэробной конверсии биомассы, полученной после культивировании A. terreus, образование метана не наблюдали. При смешивании биомассы и питательной среды в соотношении 1 : 1, выход биогаза увеличивался, содержание метана достигало 15–30%. Наибольшее количество метана образовывалось при конверсии биомассы на средах без сахарозы. Добавление сахарозы способствовало большему образованию биомассы гриба. При дальнейшем сбраживании такого субстрата анаэробным сообществом рН среды повышалось до 9 из-за высокого содержания белка (биомасса гриба) и происходящих процессов его аммонификации. Известно, что высокие концентрации аммония ингибируют ацетокластический метаногенез. Таким образом, наиболее эффективным является культивирование микромицета на среде без внесения сахарозы и использование мицелия, а не спор в качестве инокулята. Вероятно, засев мицелием приводит к более быстрой индукции комплекса целлюлозолитических ферментов. Дополнительная термическая обработка биомассы оказывала, скорее негативный эффект, на развитие микробных сообществ и выход биогаза, что может объясняться разрушением питательных веществ, в особенности, витаминов и факторов роста. Наибольшие показатели выхода метана были получены при использовании нативной биомассы. Кроме того, с экономической точки зрения, дополнительная термическая обработка – это еще и дополнительные затраты.

В то же время, общий выход метана при данной схеме эксперимента, оказался недостаточно высоким. Это может объясняться тем, что большинство грибов в процессе разложения лигно-целлюлозных отходов используют лигнин и целлюлозу одновременно, то есть лишь небольшое количество свободной целлюлозы остается для активного роста и развития бактерий и архей в микробном сообществе.

На следующем этапе изучали образование биогаза в зависимости от времени культивирования микромицета на различных типах субстратов. Для этого более активный микромицет, T. viride, выращивали на нескольких ЦСС: офисной бумаге, смеси бумаг, а также фитомассе топинамбура. Засев проводили мицелием, а для анаэробной биоконверсии использовали соотношение инокулят–среда 1 : 1. В качестве инокулята использовали сообщество ?4 и навоз КРС. Выход метана в этой серии экспериментов увеличился на 20–30% по сравнению с предыдущей серией опытов. Кумулятивное содержание метана в биогазе составило 20–52% при разложении смеси бумаг и 18–56% при разложении фитомассы топинамбура (табл. 2).

При использовании сообщества ?4 наибольший выход метана составил 36.4 мл/г топинамбура, 82.4 мл/г смеси бумаг и 65.9 мл/г офисной бумаги. Для сообщества из навоза КРС – 104 мл/г топинамбура, 96.6 мл/г смеси бумаг и 318.3 мл/г офисной бумаги. Более высокие показатели выхода метана для сообщества из навоза КРС объясняются высоким содержанием органических веществ в данном типе инокулята, а также большим количеством, активностью и разнообразием составляющих его бактерий и архей. Однако необходимо отметить, что при гидролизе смеси бумажных отходов были получены сходные показатели конверсии для обоих типов сообществ. Тот факт, что биоконверсия офисной бумаги проходила достаточно эффективно без предобработки объясняется тем, что данный субстрат практически не содержал лигнин и в исходном виде подвергался полному гидролизу и биоконверсии в метан микробным сообществом. При культивировании микромицета на офисной бумаге происходило разложение субстрата целлюлазами гриба и достаточно полное потребление доступных для грибов углеводов, не оставляя субстратов для образования метана сообществами.

Культивирование на лигнинсодержащей смеси бумаг приводило к увеличению образования биогаза сообществом КРС после предобработки культурой T. viride. Эффективность гидролиза субстрата и его конверсия в биогаз увеличивалась при предобработке грибом смеси бумаг. Максимальные значения кумулятивного содержания метана (52.3%) достигалось в том случае, когда гриб культивировали 3 сут (табл. 2). При использовании навоза КРС предобработка бумажной продукции позволяла повысить выход метана. В то же время, использование суммарного сообщества ?4, состоящего из нескольких активных и стабильных сообществ, селекция которых проходила с использованием отходов бумажной продукции, показало, что на смеси бумаг нет необходимости в предобработке субстрата грибом. Эти результаты, в свою очередь, подтвердили необходимость селекции разнообразных микробных сообществ, которые позволят благодаря своей активности частично или полностью отказаться от стадии предобработки бумажной продукции.

Топинамбур (Helianthus tuberosus) – многолетнее травянистое растение, культивируемое ради его клубней, в основном для производства инулина и пищевой клетчатки, прекрасно растущее в умеренном и холодном климате. Его биомассу можно использовать для получения биоэтанола и биогаза. Надземную фитомассу топинамбура можно рассматривать как крайне выгодный косубстрат. Так, при конверсии в метан биомассы гриба, выращенного на топинамбуре, максимальные показатели образования биогаза (45% метана) сообществом ?4 были достигнуты на 3–9 сут культивирования T. viride (табл. 2), а выход метана увеличивался в 1.5 раза. В то же время сообщество навоза КРС было более эффективно на этом субстрате без предобработки грибом (56.3%), что можно объяснить исходным разнообразием и высокой активностью содержащихся в навозе КРС целлюлозолитических и метаногенных микроорганизмов.

Использование грибов является перспективным способом предобработки лигнинсодержащих бумажных отходов и растительных косубстратов. Наиболее гидролизуемыми субстратами оказались офисная бумага, картон, а также смесь различных бумаг. Сравнение целлюлозолитической активности двух грибов позволило отобрать более эффективный для проведения гидролиза субстратов гриб T. viride. Установлено влияние условий культивирования микромицетов (состав питательной среды, наличие косубстрата, способ засева, вид инокулята) и обработки грибной биомассы на ее последующую конверсию в биогаз микробными сообществами, что позволило оптимизировать процесс получения биогаза. Селекция анаэробных микробных сообществ для получения максимального выхода метана в ряде случаев позволяет частично или полностью элиминировать стадию предобработки целлюлозосодержащих субстратов. При прямом использовании метаногенного сообщества из навоза КРС предобработка повышала эффективность образования биогаза из смеси бумаг. С помощью суммарного микробного сообщества в 1.5 раза удалось увеличить выход биогаза из фитомассы топинамбура после его предобработки грибами.

Авторы выражают благодарность А.И. Шестакову (кафедра микробиологии, МГУ им. М.В. Ломоносова) за помощь в проведении газовой хроматографии. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 16-14-00098.